Dois anos depois do golpe militar de 28 de Maio de 1926, o Aljube passou a ser uma cadeia política para presos do sexo masculino em cumprimento de penas ou sem processo, às ordens das várias polícias políticas.
Em 1934, o Aljube tornou-se um dos estabelecimentos prisionais administrados diretamente pela PVDE. Destinava-se aos presos políticos preventivos. Aí permaneciam enquanto decorria a instrução dos seus processos e aguardavam julgamento ou a transferência para o desterro. Em 1935, as celas, até então coletivas, foram individualizadas. Foi também colocada uma rede divisória entre os visitantes e os presos no parlatório.
A partir de 1943, foram erguidas, no segundo andar do edifício, treze celas de isolamento, os chamados «curros» ou «gavetas». Mantidas quase todas numa semiobscuridade durante 24 horas por dia, tinham cerca de um metro de largura, com catres basculantes, que, quando estavam para baixo, não possibilitavam a circulação do preso. Cada um desses treze “curros” era fechado por duas portas, uma gradeada e outra de madeira com um pequeno postigo.
Durante o primeiro período de incomunicabilidade, que podia durar até seis meses, prorrogáveis por mais tempo se assim o autorizasse o ministro do Interior, o preso não tinha nem caneta, nem lápis, nem papel, nem jornais, nem livros, nem relógio.
Existia ainda a cela n.º 14, de carácter disciplinar, ao lado dos sanitários, sob as escadas, onde o preso permanecia às escuras, sem enxerga e, frequentemente, a pão e a água.
Já a sala coletiva 2A, «com uma só janela gradeada e coberta por uma rede fina», tinha catres com enxergas e mantas. Os catres eram recolhidos durante dia. Lino Lima contou que, à chegada ao Aljube, o responsável pela cadeia lhe perguntou se queria ir para os quartos, onde tinha direito a lençóis e a ver o Tejo, pagando dez escudos por dia. Mas, como o recém-chegado se recusou a pagar, foi metido na sala 2A.
Segundo um relatório da Amnistia Internacional de 1963, no Aljube, durante o período de isolamento, não era permitido nenhuma forma de recreação, estando o preso completamente sozinho. Após a fase de interrogatório, nos primeiros trinta dias, os presos eram habitualmente colocados nas celas de 4 camas, sem aquecimento e assistência médica e com péssima alimentação. Esta era fornecida pela cadeia do Limoeiro, situada ao lado do Aljube. Falar alto, assobiar, fazer ruído ou chamar dava direito a castigo severo. O almoço era fornecido às 11 horas, o jantar às 18 horas e, por volta das 21 horas, o detido recebia um púcaro de café, que devia durar até ao final do dia seguinte.
Na sequência de uma visita, em 1963, do Lord Russell of Liverpool, deputado conservador britânico, que então criticou as péssimas condições da prisão, esta foi fechada em agosto de 1965. Os detidos foram transferidos para o Depósito de Presos de Caxias.
